PCR 實驗室的潛在污染來源

①臨床標本中存在的大量待測微生物或待測靶核酸

②科研中得到的質?？寺?/p>

③以前分析研究的特定微生物或靶核酸

④大量存在于實驗環境中的特定微生物或靶核酸

⑤以前擴增產物的殘留污染,這也是 PCR 實驗室容易產生的將造成假陽性的“污染”。 

PCR擴增可以引起實驗室中擴增產物的累積,通常一次典型的PCR 擴增可以產生109拷貝的靶序列,如果氣溶膠化,甚至小的氣溶膠都會含有106拷貝的擴增產物。如果不加以控制,在短期內累積的氣溶膠化的擴增產物即會污染實驗室中的試劑、儀器設備和通風系統,從而造成嚴重的實驗室“污染”,出現大量的假陽性結果。

02

?PCR 實驗室的防污染措施?

進行PCR操作時，操作人員應該嚴格遵守一些操作規程，大程度地降低可能出現的PCR污染或以防污染的出現。

(一) 劃分操作區

目前，普通PCR尚不能做到單人單管，實現完全閉管操作，但無論是否能夠達到單人單管，均要求實驗操作在三個不同的區域內進行，PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區內進行：

1.  試劑準備區。

2．標本制備區。

3.  PCR擴增區及分析區。

各工作區要有隔離，操作器材，要有方向性。如：試劑準備→標準制備→PCR擴增區及分析區。

切記：任何一間的產物及器材不要拿到其他兩個工作區。

(二) 分裝試劑

PCR擴增所需要的試劑均應在生物柜、裝有紫外燈的工作臺或負壓工作臺配制和分裝。加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來吸取擴增后的DNA和其他來源的DNA：

1．PCR用水應為高壓的雙蒸水；

2．引物和dNTP用高壓的雙蒸水在無PCR擴增產物區配制；

3．引物和dNTP應分裝儲存，分裝時應標明時間，以備發生污染時查找原因。

(三) 實驗室的嚴格分區及工作程序的嚴格遵守

試劑準備區、樣本準備區、擴增區、檢測區等須備有其各自需要的儀器設備、工作服、手套、加樣器和通風系統。在每個區使用的試劑和廢物,須直接在其各自的區域內分裝或包裝。操作人員須注意以防通過他們的頭發、眼鏡、首飾和衣服將擴增產物從污染區攜帶至清潔區的可能性。

(四)化學方法

實驗臺面可使用10%的次氯酸鈉(漂白劑)清洗,然后再用70%乙醇或清水洗去次氯酸鈉。次氯酸鈉具有氧化損傷核酸的作用,從而使可能的留在實驗臺面的擴增產物被破壞掉。要注意的是,次氯酸鈉不能區分提取的目的 DNA 和 PCR 擴增產物,用次氯酸鈉處理的樣本不能用于核酸擴增檢測。在實際工作中,有些物品比如放置擴增反應管的盤須從污染區轉回到清潔區時,在轉回之前,應將其置于2%~10%的次氯酸鈉溶液中過夜,并充分沖洗。

(五)擴增產物的修飾

如對以前擴增產物進行適當修飾,應可以消除其污染后面新的擴增檢測,但為不影響靶核酸的擴增檢測,擴增產物修飾方法須遵循兩個基本原則:

一是擴增產物被修飾后,應可以與隨后打增的靶序列區分

二是修飾不能干擾正常的擴增檢測。

(六) 實驗操作注意事項

盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進行擴增反應是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的環節都應該注意：

1.  戴一次性手套，若不小心濺上反應液，立即更換手套；

2.  使用一次性吸頭，嚴禁與PCR產物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染；

3.  避免反應液飛濺，打開反應管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面；

4.  操作多份樣品時，制備反應混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應的準確度；

5.  后加入反應模板，加入后蓋緊反應管；

6.  操作時設立陰陽性對照和空白對照，即可驗證PCR反應的可信性，又可以協助判斷擴增系統的可信性；

7.  盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器容易受產物氣溶膠或標本DNA的污染，使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種加樣器，至少PCR操作過程中加樣器不能交叉使用，PCR產物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區；

8.  重復實驗，驗證結果，慎下結論。

03

?實驗室污染的監測?

一個好的實驗室，要時刻注意污染的監測，考慮有沒有污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，預防和消除污染。

對照試驗

1、陽性對照：在建立PCR反應實驗室及一般的檢驗單位都應設有PCR陽性對照，它是PCR 反應是否成功、產物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志。陽性  對照要選擇擴增度中等、重復性好，經各種鑒定是該產物的標本，如以重組質粒為陽性對照，其含量宜低不宜高(100個拷貝以下)。但陽性對照重組質粒及高濃度陽性標本，其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大.因而當某一PCR試劑經自己使用穩  定，檢驗人員心中有數時，在以后的實驗中可免設陽性對照。

2、陰性對照：每次PCR實驗務必做陰性對照。它包括①標本對照：被檢的標本是血清就用鑒定后的正常血清作對照；被檢的標本是組織細胞就用相應的組織細胞作對照。②試劑對照：在PCR試劑中不加模板DNA或RNA，進行PCR擴增，以監測試劑是否污染。

3、重復性試驗

4、選擇不同區域的引物進行PCR擴增

04

?實驗室污染的消除?

實驗室一旦發生污染，檢測工作應立即停止，直到確認消除污染后才能重新開始檢測。要查找污染源和明確污染范圍。然后，根據污染源和污染范圍采取去污染措施，結合各種不同方法以達到好效果。

1.標本污染生物柜的操作臺造成局限污染時：

立即用吸水紙覆蓋，并使用0.55%含氯消毒劑進行噴灑消毒。消毒液需要現用現配，24小時內使用。

2.標本傾覆造成實驗室污染時：

保持實驗室空間密閉，避免污染物擴散。立即使用潤濕有0.55%含氯消毒劑的毛巾覆蓋污染區。需要時（如大量溢撒時）可用過氧乙酸加熱熏蒸實驗室，劑量為2g/m3，熏蒸過夜；或20g/L過氧乙酸消毒液用氣溶膠噴霧器噴霧，用量8ml/m3，作用1-2小時；需要時或用高錳酸鉀-甲醛熏蒸：高錳酸鉀8g/m3，放入耐熱耐腐蝕容器（陶罐或玻璃容器），后加入甲醛（40%）10ml/m3，熏蒸4小時以上。熏蒸時室內濕度60%-80%。

3.清理污染物時：

嚴格遵循活病毒生物操作要求，采用壓力蒸汽滅菌處理，并進行實驗室換氣等，以防再次危害。

05

?新冠病毒核酸檢測常見問題?

1、新冠試劑出現翹尾，怎么處理？

答：如果是個別單一通道翹尾，不管是FAM還是VIC通道，先按照要求復查，復查建議重新采樣，如果不方便重新采樣建議對原有樣本進行重新提取核酸驗證，如果復查陰性判讀陰性，如果復查還是同一通道翹尾，就要對結果仔細審核，一是要排除實驗室污染，二是要對病人信息了解清楚，從臨床癥狀及接觸史排查，如果沒法確認，建議須重新采樣復查，如有需要可以采用另一家試劑來驗證。如果出現大量的弱陽性擴增翹尾，主要原因是考慮實驗室污染，可以通過做環境樣本和陰性對照做驗證排除。

2、N基因和1ab基因是新冠病毒的基因嗎，靈敏度哪個更高？是否會和其他冠狀病毒片段重疊？

答：N基因跟1ab都是特異的，不會跟其他呼吸道病原體交叉反應。設計時候，兩個基因的序列不一樣，導致靈敏度不一樣，N基因的靈敏度比1ab靈敏度高。

3、新冠檢測結果和臨床診斷不符合，怎么解讀？

答：新冠病毒由于是RNA病毒，容易降解，另外檢測結果也和取樣，核酸提取以及樣本本身的核酸濃度有關，需要逐一分析，同時可以結合臨床癥狀判讀。

4、采用生理鹽水做陰性對照，內標也會增長，怎么解釋？

答：因為試劑采用的是內源性內標，內源性內標是用人源基因標記，此基因存在于人的表皮細胞內，操作過程中就可能會出現人源性的污染，另外環境污染也有可能導致內標增長，這也是前面提到的建議做環境樣本質控。

5、新冠樣本內標不出如何處理？

答：如果新冠樣本內標不出，該樣本須復查，可重新混勻該樣本提取核酸，如果重新提取該樣本內標還是不出，在排除提取問題的情況下，說明采樣不合格，要通知臨床重新采樣復查。

6、采集環境樣本檢測新冠狀病毒，為啥大部分樣本內標不出，偶爾個別樣本檢測出內標？

答：因為新冠試劑檢測的是人內源性內標，環境樣本一般不含有人源細胞，所以檢測不出內標；偶爾檢出內標，可能該環境樣本上有人源性細胞粘附，故而檢出內標。